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UV1901PC紫外可見分光光度計檢測蛋白質(zhì)的方法

紫外可見分光光度計簡介：

隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展和進(jìn)步，現(xiàn)代分光光度的測試手段和方法都在不斷改進(jìn)，但zui根本的依據(jù)仍然建立在朗伯-比爾定律的基礎(chǔ)之上。

A=KLC

式中：

A-為被測物在給定波長的需光吸光度值

     K-為一系數(shù)，稱為溶液的吸收系數(shù)（與入射光波長及被測物質(zhì)的特性有關(guān)）

     L-為被測物質(zhì)的厚度（一般與比色池的厚度有關(guān)）

     C-為被測物質(zhì)的濃度

    由上式可以看出，被測物質(zhì)對單色光的吸光度與被測物質(zhì)的濃度成正比。

實際測試時，單色光通過被測物質(zhì)達(dá)到光電接收器中，由光電倍增管或光電池轉(zhuǎn)換成光電流，而光電流的強弱決定了吸光度值A的大小。假定通過參比樣品的光電流為I。，而通過待測樣品的光電流為I，則兩者之比設(shè)定為τ，也稱透射比（或以T%表示，稱為透過率）。則：

τ=I/ IO×100%

朗伯-比爾定律的貢獻(xiàn)就是發(fā)現(xiàn)了透射比的負(fù)對數(shù)值（也就是吸光度A）的變化與物質(zhì)的濃度的變化呈正比關(guān)系。即：

A=-lgτ或lg（IO/I）=KCL

    同時，不同的物質(zhì)對不同波長的單色光呈現(xiàn)出不同的吸光度值，這一變化特征也就是分光光度法用于物質(zhì)的定性定量分析的理論基礎(chǔ)。

基于上述原理，就可以知道無論是以往的儀器還是現(xiàn)在的儀器，其zui基本的工作要求都是能準(zhǔn)確獲得物質(zhì)（或稱樣品）在某一波長的透射比或在某一個光譜波長范圍的吸光度變化特性（具體說光譜特性譜圖）。而UV1901PC/UV1902PC雙光束紫外可見分光光度計，能同時測量參比樣品和待測樣品。由于參比樣品和待測樣品是同時測量的，所以任何由光源帶來的影響都被抵消了，從方法上保證了測量度。

UV1901PC紫外可見分光光度計檢測蛋白質(zhì)的原理：

根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比.

蛋白質(zhì)可作定量分析的原因：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在275—280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在zui大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經(jīng)驗公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來測量蛋白質(zhì)含量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算： 

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.4280-0.74A260  

(A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值) 還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量： 蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d 

其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子 

（4）稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定的經(jīng)驗公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在200—250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗公式： 

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225） 

（A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在215nm和225nm處測得的吸光度值。

儀器與試劑 

儀器：uv-1901pc紫外-可見分光光度計

UV1901PC紫外可見分光光度計特點：

采用濱松無臭氧環(huán)保型氘燈，普通長壽命氘燈會有臭氧產(chǎn)生，長期吸入對身體有害，無臭氧長壽命氘燈就可以有效避免。儀器還采用德國歐士朗鎢燈，美國派來芝檢測器，雙光束光學(xué)系統(tǒng)，加厚光學(xué)底板，更能保證儀器的穩(wěn)定性。操作界面和操作系統(tǒng)都是簡便快捷版的，減少了檢測時間的同時，增加準(zhǔn)確性.吸光度可以到小數(shù)點后四位。可選配多種附件，自動四聯(lián)池，七聯(lián)池，恒溫裝置，透過率固體架，反射率固體架等。

比色管（10ml的5個），吸量管。 試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液（牛血清白蛋白）。

實驗過程：

啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時。 

用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比（參比溶液不可取出）. 

在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描，設(shè)置掃描參數(shù)（起點：400nm，終點：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描） 

將兩個均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測量池中，進(jìn)行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調(diào)回光譜掃描。 

附加：吸收曲線的制作:（找出zui大吸收波長） 

將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，點擊START進(jìn)行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的zui大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為   。  

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 

在工作界面上選擇測量項目為光度測量設(shè)置測量條件（測量波長：278.00 nm）。 

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在278nm處分別測定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

樣品測定： 

配制三份待測蛋白質(zhì)溶液，（取待測蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測蛋白質(zhì)溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。